- 发布日期：2025-01-04 15:28 点击次数：134
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（这里讨论的大肠杆菌为非分泌到培养基中的重组蛋白，是否有重组蛋白分泌到培养基中的工程菌我没有见过。）
大肠杆菌表达的基因工程蛋白是纯化人员最方便获得的原料，对纯化工艺开发来说几乎没有原料方面的限制。常看到有战友用个几毫升的菌液去做纯化，对此我十分不解，同样要做，为什么不多做点呢？很少的菌体会给纯化带来一些难以估计的问题，工艺的重复性和放大往往出现问题。因此，要做个好工艺就多发酵表达一些菌体吧。我做纯化时，初始工艺摸索用的菌体量一般为10g左右。
我们应该关心的是目标蛋白在什么缓冲体系下是可溶的，在什么缓冲体系下是不溶的！不要让包涵体这个概念给你误导。
怎么讲这一节呢？各种纯化的原理我就不讲了，也不可能有瑞典老兄书上讲得好（GE层析的根在瑞典的uppsala），还是举例来说明吧，做一些简单的分析。讲两个实例，一个是可溶表达的蛋白，一个是不可溶表达的蛋白。
一般对离子交换层析来说，与等电点相差2个pH单位就可以有效吸附。此步的缓冲体系pH为5.8，这个差值达到了4，比较特殊。确定此pH值经过了多次的小试研究，高点的pH蛋白A都难以吸附完全，也不利于梯度洗脱分离，这点当时很难理解。后来在研究蛋白A的理论滴定曲线时，终于找到了理论依据。原来蛋白A的理论等电点虽然为9.7，但在滴定曲线上，从9.7到6.5的很长一段曲线都是平缓的。也就是说从pH9.7到pH6.5，蛋白A所带的净正电荷都很少，只有0—1个单位左右。当pH为5.8时，蛋白A的净正电荷达到3个单位，这时才能有效吸附。通过本例也可以发现，决定蛋白吸附的不是等电点的差异多少，而是所带净电荷的多少。可能一个蛋白质x比蛋白质y的pI高，但在某个pH时，蛋白y可以吸附阳离子柱，而蛋白x却吸附不好。所以，在理论上，做纯化要善用滴定曲线的差异，特别是小分子的蛋白质，它们普遍有着净电荷与pH不敏感的现象。
